痰培养、尿培养、脓培养、粪便培养中感染菌的判断

摘要

由于国内外被广泛认可的、经得起临床实践验证的、从理论到实践体系完整的标准操作流程体系的缺乏，对于带正常菌群标本中真正感染菌的判断一直以来就是令国内外临床一线微生物检验人员和临床医生最为头痛的问题。我们借鉴美国《临床微生物学手册》（manual）与美国《临床微生物检验流程操作手册》（handbook）编写的中心思想，结合自身从业多年的临床实践经验，建立了一整套以免疫学基本原理中趋化、包裹（浸润）、吞噬为中心思想，以及由此衍生出来的以识别吞噬和包裹现象为主要识别技术要点的，对带菌群标本中感染菌识别的方法体系，很好地解决了这一困扰临床微生物检验人员多年的难题。文章详细地叙述了我们建立的方法学中痰培养、尿培养、脓培养以及粪便培养的技术要点，结合图文，生动形象地呈现出我们的工作总结。

带正常菌群标本中真正感染菌的判断一直以来是令国内外临床一线微生物检验人员和临床医生最为头痛的问题，统一可靠的、从理论到实践体系完整的标准操作流程的缺乏，使得国内外不同地区，甚至不同医院做法不一致，至今仍处于各自为政的混乱局面。这个局面不仅给临床的诊断和治疗带来无法消除的困惑，更为严重的是大量假阳性报告充彻临床，对临床用药方向造成负面干扰，带来对患者治疗过程的曲折，增加了患者的痛苦和医疗费用的支出，甚至使危重症感染错失正确的治疗时机而导致患者死亡。因而正确识别带菌群标本中的病原体，将其从杂乱的菌群中正确地分离出来，是我们工作的核心和重心。

我们借鉴美国《临床微生物学手册》（manual）[1] 与美国《临床微生物检验流程操作手册》（handbook）[2] 编写的中心思想，结合自身从业多年的临床实践经验，建立了一整套对带菌群标本中感染菌识别的方法体系，现介绍给同道。

01

体系中心思想

1.1感染、定植、污染、正常菌群等基本概念[3]

感染：指寄生生物侵入宿主，导致被侵犯部位组织结构损害，生理功能无法正常进行的一种寄生状态。

定植：指寄生生物进入宿主，黏附于宿主黏膜——皮肤或开放性生理腔道黏膜，在这些部位“定居”，并开始无害性繁殖的寄生状态。

污染：在采集过程中，无意识地引入与样本不相关的干扰物质（包括微生物）的过失行为。

正常菌群：指从出生以后就一直存在于人体某个部位的菌群，这些菌群与人体是一种共生关系，又叫原籍菌群。

定植菌：原本不属于人体某个部位的原籍菌，因为某些原因（医疗操作、抗菌药物使用等）而到达这些部位，取代原籍菌而存在的一类微生物。

感染菌：侵入人体正常组织内部导致组织结构和功能破坏的有害细菌。其来源主要是意义明确的致病力较强的致病菌，如结核分枝杆菌、霍乱弧菌、鼠疫耶尔森菌等，以及具有潜在致病能力的条件致病菌，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等，这是临床感染的主体，绝大多数感染都是由条件致病菌导致的。另外，还有一些毒力低下、通常情况下难以感染人体的非致病菌在特殊情况下，因医源性操作或外伤等将细菌/ 真菌直接带入到人体无菌部位，或因为患者免疫力丧失（如血液病、干细胞移植、实体器官移植、获得性免疫缺陷综合征）而导致非致病菌突破免疫屏障而导致感染。

菌群破坏与条件感染：人体微生态由免疫系统、正常菌群和环境菌群构成，在正常情况下各菌群的数量与比例构成始终处于动态平衡中，维持着人体正常的功能。但当某部位菌群因为抗菌药物、消毒剂而被损伤，或因为激素维持的局部微环境的改变和分泌性免疫球蛋白（s-IgA）分泌量下降导致菌群结构的改变等原因，将导致原籍菌群破坏，被定植菌所取代，形成新的菌群，此时的菌群与健康人可能很不一样，然而在该阶段，这些菌可能还未导致感染。随着屏障功能的丧失，定植抗力降低，某些条件致病菌可能突破屏障入侵深层组织，或上下行异位而导致感染。但实际上针对特定的病例，在某一横断面上，我们并不知道疾病已经进展到哪个阶段，哪种或哪些细菌/ 真菌已经导致了患者的感染。在这种情况下，原有菌群已经改变，新的菌群不一定感染，即使感染也可能因为菌群中各细菌之间的致病力差距很小，而无法判断到底哪一种会引起感染，此时站在微生物角度去解决实际问题，就会步入一个死胡同。这需要我们引入新的观点，变换视角，从病原体特性无法判断，我们可以从宿主因素和宿主免疫系统的反应入手，因为感染以后一定会遇到人体免疫系统的抵御[4-5]。

1.2样本准入原则

分离潜在病原体、判断感染的前提一定是采集到能代表某个部位感染的标本，含有导致感染的病原体，同时尽可能的减少无关菌群的影响，那么一份符合采样规则的合格标本是必需的。常见带菌群部位种类以及相应的采集方法见表1。

在临床实践中，常常遇到一些不合理的标本类型，这类标本常因为不能很好的代表该部位或相邻部位的感染，不含有或含有极少的感染菌，或由于被菌群严重污染而不能被采用，这样的标本类型被美国《临床微生物手册》第7 版定义为可以直接拒收的标本，见表2。

在一些与正常生理腔道相邻接部位采集的标本中因采样方法的局限，既含有导致感染的厌氧菌，也含有正常菌群，有些类型的标本因采样方法不合理，引入过多的正常菌群而导致标本无法鉴别分离菌的临床意义，这样的标本是不能用于厌氧菌培养的，可接受与不可接受的厌氧菌培养标本类型见表3。

当我们收到标本后应该马上做的事情并非立即接种，而是标本的质量评价，只有经过评价，认定为合格的标本才有继续做下去的必要。美国《临床微生物学手册》第10 版同样也规定了验收标本的规则，表4 是我们借鉴后结合自己的工作实践制订的样本筛查规则。

1.3　带菌群部位标本中识别感染菌的基本理论

1.3.1　与感染识别有关的免疫学原理　

人体生理腔道黏膜中、黏膜下以及无菌部位分布的免疫细胞的胞膜上Toll样受体种类及分子多态性程度不同。黏膜中，由于菌群建立过程伴随着免疫耐受过程的形成，这些部位Toll样受体种类相对单一，分子多态性程度低，可识别的异源性分子种类少，因而对多数正常菌群产生免疫耐受，表现为无应答。另外，CXC受体是另一大类参与中性粒细胞趋化、活化以及增强吞噬功能的粒细胞表面受体，不同的是该受体的主要配体为IL-8，这种内源性炎症介质由受损的组织细胞分泌，刺激中性粒细胞引起细胞的趋化与活化[7]。黏膜下以及无菌部位免疫细胞的胞膜上Toll样受体种类繁多，分子多态性程度高，可识别的异源性分子种类多，对几乎所有侵入黏膜下以及无菌部位的微生物均可产生免疫应答。当机体被微生物感染时，细菌的代谢产物被Toll样受体识别，而受损组织细胞会释放各种细胞因子（如IL-8），这些因子会被CXC受体所识别；在外源性炎症介质与内源性炎症介质的共同作用下，机体免疫系统被激发，从而产生免疫应答。由于Toll样受体识别病原体后，会启动胞内信号转导，从转录水平调控受体蛋白的表达，该过程称为活化。因而经过活化的一个中性粒细胞只能识别一种病原体。与此同时，CXC受体受到IL-8的刺激，促使中性粒细胞趋化到炎症部位，通过级联反应信号转导而被活化，活化的细胞杀菌能力大幅提升；同时，CXC受体表达下调，不再对IL-8产生反应。活化后的中性粒细胞形成特异性克隆群，仅对特定病原体产生反应。在细菌和真菌的感染中，侵袭性感染是最主要的感染类型。人体对侵袭性感染的主要免疫机制就是细胞渗出——包括早期的固有免疫（中性粒细胞的浸润）和后期的适应性免疫（免疫调理和细胞毒作用）。整个过程都始终贯穿着白细胞的趋化、包裹（浸润）、吞噬、消化。胞内吞噬、多细胞包裹（浸润）是易于辨认的具有重要意义的免疫现象。只要观察白细胞与微生物之间的“斗争” ，我们就能正确区分“敌我双方”关系。因而，具有吞噬和包裹现象的微生物就是感染菌。无吞噬现象的则可能为定植菌，也可能为感染菌（如感染早期产生荚膜的细菌具有抗吞噬作用）。然而，一方面对于产荚膜的细菌/真菌，总是有荚膜低表达和无荚膜的个体，另一方面后期当有针对荚膜的非胸腺依赖性抗体产生时，在抗体与补体参与的情况下荚膜物质会被水解，以及在抗体的免疫调理作用下，吞噬能力大大加强，因此即便产生荚膜的细菌也能被吞噬。显微镜观察吞噬和包裹现象是行之有效的鉴别定植菌与感染的一种手段[8-9]。

1.3.2　影响吞噬的因素

很多因素都会影响吞噬过程，这种因素有些是增强吞噬作用，而有些则是削弱吞噬作用。其中Toll样受体与配体在白细胞的激活与识别中起到最为关键的作用；而CXC受体与配体则主要影响细胞的趋化与浸润包裹；抗体与补体可以增强调理作用，水解细菌胞外结构，增强吞噬与溶菌；而细菌/真菌荚膜则具有抗吞噬作用，会削弱细胞对病原体的识别；细菌Ⅲ型分泌系统分泌的效应蛋白将导致被动吞噬以及不完全吞噬，引起细菌在细胞内的滞留和胞内繁殖，这导致了兼性胞内菌感染的扩散和迁延。此外，曲霉等很多产生细胞毒素的病原体会诱导Th淋巴细胞释放细胞因子，间接诱导白细胞凋亡，或直接杀伤巨噬细胞/NK细胞，或直接抑制吞噬与溶菌，干扰调理作用，通过这些途径破坏免疫系统，逃避免疫杀伤，导致感染的扩散和迁延[8-9]。

1.3.3　吞噬与黏附的区别要点　

我们根据自己多年的阅片经验，总结出吞噬与黏附的鉴别要点，供同行们参考。

吞噬具备以下特点：细菌与细胞核位于同一平面；细菌位于胞浆内，而不是胞核上（溶酶体只存在于胞浆中）；根据中性粒细胞活化原理，胞内菌一般为单一种类，当一个细胞内出现多种细菌时，则肯定存在黏附，这样的视野应该舍弃；被吞噬的细菌周围有一圈微弱的不着色或着淡红色的晕圈。因为细胞膜的物理阻隔以及溶酶对细菌细胞壁的损伤，胞内革兰阳性细菌染色偏淡，甚至着色不均（斑驳染色）。并且在溶酶的影响下，胞内细菌形态往往有不同程度改变。而由于真菌孢子较大，且在溶酶作用下，体积还将进一步膨胀，因此真菌胞内吞噬则具有明显的占位现象，且着色较差；另外，当我们看到杆菌或链球菌一部分在内，一部分在外时，肯定是黏附..... 这些现象都有助于我们正确地区分吞噬与黏附，避免因黏附带来误判。具体判断方法见图1 ～图5。

图1 不在同一平面的细菌

注：（a）图中，焦距对准革兰阳性球菌，此时球菌菌体是清晰的，但革兰阴性杆菌和细胞核都是模糊的，说明革兰阳性球菌位于细胞核上，与细胞不在同一层面；（b）图中，焦距对准革兰阴性杆菌，此时细菌和细胞都是清晰的，但革兰阳性球菌是模糊的，说明革兰阴性杆菌与细胞位于同一层面，且位于胞浆中，周围有微弱淡染区，因而革兰阳性球菌判断为黏附，革兰阴性杆菌为吞噬；1 000×。

图2 吞噬细菌的细胞

注：（a）图来自金黄色葡萄球菌肺炎唤醒的痰涂片，可见胞内吞噬金黄色葡萄球菌；（b）图来自儿科CAP 患者，可以看出胞内吞噬了肺炎链球菌；（c）图来自ICU VAP 患者，吞噬的是纹带棒状杆菌；图（a）~（c）都有“斑驳着色”；1 000×

图3 肺泡灌洗液中吞噬真菌孢子的细胞

注：（a）图来自肺泡灌洗液，胞内吞噬了球形的大体积真菌孢子，未着色，胞核被挤压到边缘，形成新月形结构，培养结果为白念珠菌；（b）图来自阑尾脓液，胞内吞噬大量真菌孢子，着色斑驳，鉴定结果是近平滑念珠菌；（c）图是血液科患者的痰涂片，胞内吞噬了隐球菌孢子，受到溶酶作用后，体积膨大；1 000×

图4 阿奇霉素治疗后细胞内外细菌不一致现象

注：来自CAP 老年患者，临床采用阿奇霉素治疗成功，胞外细菌是大肠埃希菌与肺炎链球菌，而胞内菌则是卡他莫拉菌，很好的说明了胞内菌才是真正感染菌这条判定规则；1 000×

图5 氨曲南治疗后胞内外细菌不一致现象

注：来自ICU 患者的痰涂片，临床采用氨曲南治疗后缓解, 胞外菌为鲍曼不动杆菌，而胞内菌则是铜绿假单胞菌, 临床治疗反应与涂片判定结果一致，说明铜绿假单胞菌才是真正的感染菌；1 000×

1.3.4　利用活化原理及概率法判断受菌群污染较重且必须妥协的标本中的感染菌　

步骤1：搜寻脓细胞胞浆中有疑似吞噬的视野，寻找其中细菌单一的吞噬细胞；步骤2：计数20～100个有吞噬或无法区分黏附的脓细胞，计算吞噬单一细菌的细胞出现的概率， 占（吞噬+黏附）总数的30%以上即可认定为感染菌。见图6～图10。单一吞噬累计12个细胞，而单一加上多细菌的情况一共20个细胞，单一所占比例为60%，＞30%，因此将革兰阴性细小杆菌判断为感染菌，经过培养鉴定，结果为流感嗜血杆菌。

图6 吞噬单一细菌和多种细菌的细胞

注：黑色箭头所示为革兰阴性细小杆菌的单一吞噬，红色箭头是看起来多种细菌“位于胞内”的情况，其中3 个细胞为单一，1 个为多细菌；1 000×

图7 吞噬单一细菌和多种细菌的细胞

注：黑色箭头所示为革兰阴性细小杆菌的单一吞噬，红色箭头是看起来多种细菌“位于胞内”的情况，其中3 个细胞为单一，2 个为多细菌；1 000×

图8 吞噬单一细菌和多种细菌的细胞

注：红色箭头所指是看起来多种细菌“位于胞内”的情况，缺乏单一吞噬；1 000×

图9 吞噬单一细菌和多种细菌的细胞

注：黑色箭头所示为革兰阴性细小杆菌的单一吞噬，红色箭头是看起来多种细菌“位于胞内”的情况，其中5 个细胞为单一，2 个为多细菌；1 000×

图10 吞噬单一细菌和多种细菌的细胞

注：黑色箭头所示为革兰阴性细小杆菌的单一吞噬，红色箭头是看起来多种细菌“位于胞内”的情况，其中1 个细胞为单一，2 个为多细菌；1 000×

02

主要带菌群标本操作流程体系构架[10]

2.1　痰培养标本

图11 为成都市第五人民医院痰涂片诊断体系的操作流程，大致经历了12 个环节，最后的综合报告则整合了实验室和临床的所有必需信息。

2.2　尿培养标本

图12 为成都市第五人民医院的尿液操作流程，在国内大多数医院采用的环节基础上，增加了离心沉渣镜检与质量评价的环节。

2.3　粪便培养标本

图13 为成都市第五人民医院采用的粪便微生物学检验总体操作流程；图14为肠道菌群失调后艰难梭菌和金黄色葡萄球菌二重感染检验分段操作流程；图15为成都市第五人民医院原发性感染性腹泻粪便微生物检验分段操作流程。

图11 成都市第五人民医院痰培养操作流程

图12 成都市第五人民医院尿培养操作流程

图13 成都市第五人民医院粪便微生物检验

总体操作流程

图14 成都市第五人民医院肠道菌群失调后

艰难梭菌和金黄色葡萄球菌二重感染检验

分段操作流程

图15 成都市第五人民医院原发性感染性

腹泻粪便微生物检验分段操作流程

上述流程在陈东科、孙长贵教授主编的《实用临床微生物检验与图谱》一书中也有详细叙述。

03

主要带菌群标本中感染菌的识别与判断

3.1　痰培养标本中感染菌的识别与判断

我们根据自己从业经验结合对美国《临床微生物学手册》[1] 相关章节的深入解读，制订了痰培养标本感染菌的识别标准，见表5。

痰培养感染菌判断需要的条件主要有：WBC++ 以上；鳞状上皮细胞＜ 10/LP；细菌单一、2 种或数种但菌体瘦弱（肺脓肿）；能发现典型的胞内吞噬或包裹。

3.2　尿培养标本中感染菌的识别与判断

我们根据自己从业经验结合对美国《临床微生物学手册》[1] 相关章节的深入解读，制订了尿培养标本感染菌的识别标准，见表6。

尿培养感染菌判断需要的条件主要有：WBC>10/HP；细菌单一或2 种；阳性球菌计数>104/mL 或阴性杆菌计数>105/mL（非尿袋/ 管标本、抗菌药物使用前、严格2 h内送检）；沉渣涂片能发现典型的吞噬（适用于抗菌药物使用后、未严格2 h 送检的情况）。

3.3　粪便培养标本中感染菌的识别与判断

粪便感染鉴别要点：WBC>10/HP 提示侵袭性感染，可见到吞噬；水样便为主的肠毒素感染WBC 常被稀释或缺乏，没有指导意义；粪便培养识别感染菌的主要手段是以已知常见病原体的筛查为主，如沙门菌、志贺菌、小肠结肠耶尔森菌、弧菌、气单胞菌等；粪便涂片对弯曲菌的快速诊断有意义，对严重菌群失调有意义，但对轻中度菌群失调没有诊断价值。

3.4　脓液标本中感染菌的识别与判断[1-11]

脓液培养感染菌的识别要点：WBC++以上；感染菌有典型的胞内吞噬；大多数脓肿以厌氧菌为主，厌氧菌以混合感染居多，菌体大多瘦弱；腹腔脓肿，肠杆菌科细菌混合厌氧菌感染多见；真菌感染往往出现在腹腔、阑尾、前庭大腺以及头皮皮下，病原体单一；结核性冷脓肿以淋巴结、脊柱旁多见；乳腺脓肿以金黄色葡萄球菌为主。

总结：对于带菌群标本中感染菌的识别原则，主要还是以免疫学原理指导下的吞噬与包裹为鉴别要点，以合格标本和细胞学提示感染为前提。

参考文献

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[9] 郭晓奎. 细胞微生物学[M]. 上海：第二军医大学出版社，2004.

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